Awọn atunṣe si eyikeyi ninu awọn ẹya ara ẹrọ ti Aṣeyọri Ibiti Ẹrọ Muṣamuwọn (PCR) le ṣe atunṣe didara abajade, boya nipasẹ imudarasi tabi dinku ikore ọja ati didara tabi nipa imudarasi ifarahan pato ati ifarahan. Awọn ipinnu ti o ni ipa lori opin esi le jẹ boya ara (ie, otutu, awọn akoko gigun) tabi kemikali (ie, idaniloju awoṣe, oriṣi enzymu ti a lo). Awọn atẹle wọnyi ni awọn ifunni pataki kan ti o ni ipa lori aṣeyọri PCR.
01 Ibi-itọju Laabu Imọ
Niwon PCR jẹ o lagbara ti n wa iyipo kan ti DNA, o ṣe pataki lati ṣetọju awọn ipo didara ni yàrá-yàrá. Mimu ibọwọ titun mu nigbagbogbo, lo awọn itanna giramu ti o wa ni ifo ilera, awọn itanna ati awọn pipoti pipette ati awọn solusan to ni ipilẹ, ati ki o nu ibi iṣẹ naa ṣaaju ki o to bẹrẹ iṣẹ.
Nigbagbogbo ni awọn aati iṣakoso, nigbagbogbo pẹlu DNA awoṣe ati laisi enzymu, lati rii daju pe awọn abajade jẹ otitọ nitori titobi ti ayẹwo to dara.
Ọpọlọpọ eniyan rii daju pe wọn ni awọn iṣeduro ti ara wọn ti a ko pín lati ṣe iṣoro laasigbotitusita ati pe awọn pipoti ti a ti pin ni a ma pin si fun PCR nikan. DNase ati awọn tubes PCR RNase-free, awọn itọnisọna pipetoti aisan-afẹfẹ ati ṣiṣe ni ipo fume pẹlu imọlẹ UV jẹ ọna miiran lati dinku awọn iṣoro.
02 Awọn ohun elo kemikali
- Ni awọn ipilẹ 18 si 24
- Ṣe ko ni itọsiwaju atẹle (ie, hairpin loops)
- Ṣe pinpin iwontunwonsi G / C ati awọn ẹgbẹ A / T
- Ṣe ko ṣe atunṣe fun ara wọn ni awọn ipari 3-ẹsẹ
- Ni awọn iwọn otutu ti o nyọ (Tm) ni iwọn 5-10 degrees Celcius ni isalẹ awọn iwọn gbigbọn, eyiti o jẹ laarin 55 ati 65 degrees Celsius
Tm fun awọn alakoko mejeji yẹ ki o tun jẹ iru fun awọn esi to dara julọ.
03 Ikanpọ Mix: Awoṣe ati Awọn Alakoko
Awọn ifọkansi alakoko ti o dara ju laarin 0.1 ati 0,6 micromoles / L. Iye awoṣe yatọ si da lori iru DNA (eniyan, kokoro, plasmid).
Pẹlu awoṣe ti o kere pupọ, awọn ilana miiran wa lati mu awọn esi pada, bi awọn nọmba ọmọde ti o pọ tabi lilo ti "ibere ibẹrẹ." Ṣe idanwo awọn alakoko tuntun nigbagbogbo pẹlu iṣakoso iṣakoso rere, lati rii daju pe wọn ṣiṣẹ labẹ awọn ipo idaniloju pato rẹ.
04 Idaran Dada: Eroja Enzyme
Iṣeduro ti MgCl2 ni idaniloju imudara le ni ipa lori abajade PCR ati pe o le ṣe ipa pataki ni diẹ ẹ sii ti o pọju. Awọn cationium cation fọọmu awọn iṣelọpọ eka pẹlu dNTPs lati ṣe awọn substrate gangan ti polysarase enzyme mọ.
Iwọn deede ti gbogbo awọn dNTPs mẹrin tun ṣe iranlọwọ lati dinku oṣuwọn aṣiṣe polymerase. Awọn afikun kan gẹgẹbi betaine, BSA, detergents, DMSO, glycerol, ati pyrophosphatase tun le ni ipa lori pato imudaniloju tabi ṣiṣe atunṣe.
05 Iru ti Thermocycler
Nigbati o ba n ṣaja fun awọn ohun elo ẹrọ yàrá, jẹ kiyesi pe diẹ ninu awọn thermocyclers ko kere ju awọn miiran lọ ni mimu awọn gangan, awọn iwọn otutu ti o fẹ.
Eyi jẹ agbegbe kan nibiti o ṣe lọ owo-owo ko ni san ni pipa ni igba pipẹ nigba ti o ba ni ifojusi pẹlu atunṣe tabi lilo awọn alailẹgbẹ ti o nilo aaye ti o ni ibiti o ti ni iwọn otutu.
Awọn tubes ti nmu ti a fi oju ṣe pataki ti a ṣe lati fi ipele ti awọn ami ti thermocycler ti o nlo, tun ṣe iranlọwọ mu awọn iwọn otutu lenu.
06 Awọn Eto Eto Cycle
A le mu ikore ti o pọ sii nipasẹ sisun akoko igbasilẹ nipa gbogbo ọdun 20, lati san owo fun oṣuwọn ti kii din si lati ṣe afikun awọn awoṣe sii. Ni igbagbogbo, o kere ju ogoji 40 lọ to lati ṣe afihan awọn ohun elo to kere ju 10 lọ si idojukọ to tobi to wo lori geli agarose ti o ni irawọ ti iṣan bromide.