Iwọn ti imototo ti amọri ti a beere da lori idaduro opin ti a pinnu fun amuaradagba.
Fun diẹ ninu awọn ohun elo, ohun elo ti o fẹrẹ jẹ to. Sibẹsibẹ, fun awọn ipa miiran, bii ninu awọn ounjẹ ati awọn oniwosan, a nilo ipele giga ti iwa-mimu. Lati ṣe aṣeyọri awọn ọna amọdawọn amuaradagba pupọ ni a maa n lo, ni awọn ọna igbesẹ mimọ.
Igbesẹ imudanilokan isọdọmọ kọọkan maa n ni abajade diẹ ninu awọn iyọnu ti isonu ọja. Nitorina, imọran imudaniloju amọdaju amọdaju ti o dara julọ jẹ ọkan ninu eyi ti ipele ti o ga julọ ni idiwọn diẹ ninu awọn igbesẹ. Yiyan awọn igbesẹ ti o lo lati da lori iwọn, idiyele, solubility ati awọn ini miiran ti amuaradagba afojusun. Awọn ọna wọnyi ni o yẹ julọ fun iwẹnumọ amuaradagba cytosolic kan. Mimọ ti awọn ile-iṣẹ amuaradagba cytosolic jẹ diẹ idiju ati nigbagbogbo nbeere pe awọn ọna oriṣiriṣi ni a lo.
Awọn Igbesẹ akọkọ fun Imọlẹ Protein
Igbese akọkọ ni sisọ intracellular (inu alagbeka) awọn ọlọjẹ ni igbaradi ti ẹda robi .
Eyi yoo ni awọn adalu ti eka ti gbogbo awọn ọlọjẹ lati inu cell cytoplasm, ati diẹ ninu awọn macromolecules afikun, awọn cofactors, ati awọn ounjẹ. O le lo awọn ọja ti o wa ni erupẹ fun awọn ohun elo ninu imo-ẹkọ biotech, sibẹsibẹ, ti mimọ jẹ ọrọ kan, awọn igbesẹ ti o le tẹle ni a gbọdọ tẹle.
Awọn idokuro amuaradagba amọdaro ti pese sile nipasẹ yiyọ awọn idoti ti cellular ti a ṣe nipasẹ cell lysis, eyi ti o waye nipa lilo awọn kemikali ati awọn enzymu , sonication tabi French French. Awọn ipalara ti wa ni kuro nipasẹ centrifugation, ati awọn onibara ti wa ni pada. Awọn ipese ti ọdẹ fun awọn ọlọjẹ extracellular ni a le gba nipase yiyọ awọn sẹẹli nipasẹ centrifugation.
Fun awọn ohun elo imọ-ẹrọ imọ-ẹrọ kan, o wa fun idiwọn awọn enzymu ti afẹfẹ : Awọn Enzymu ti o le farada awọn iwọn otutu ti o gaju laisi wahala, ati lakoko mimu iṣẹ ṣiṣe pataki kan. Awọn eda ti o ṣe wọn ni a npe ni extremophiles ni igba miiran. Ọna ti o rọrun lati ṣe atunse amuaradagba ooru kan ni lati sọ awọn ọlọjẹ miiran ninu adalu nipasẹ gbigbona, lẹhinna itutu agbaiye (eyi ti o jẹ ki enikanmu ti o le ṣe atunṣe tabi tun pada, ti o ba jẹ dandan.
Awọn igbesẹ ti igbasẹ laarin Intermediate
Ni iṣaju, igbasẹ keji igbasẹ lati ṣe iwadii kan amuaradagba lati inu ẹda rorun ni nipasẹ ojutu ninu ojutu pẹlu agbara osmotic giga (ie iyọ iyọ). Awọn ohun elo nucleic ninu apẹẹrẹ rorun ni a le yọ kuro nipasẹ awọn aggregates ti o ṣẹda pẹlu sulfate streptomycin tabi imi-ọjọ imi-ọjọ.
Ilana ojutu ti a ṣe nigbagbogbo ni lilo sulfate ammonium bi iyọ.
Awọn ọlọjẹ ti o yatọ yoo ṣokasi ni awọn ifọkansi ti o yatọ si imi-ọjọ imi-ọjọ ti sulfate ammonium . Ni apapọ, awọn ọlọjẹ ti iwukara molikalẹ ti o ga julọ ntàn ni awọn ifọkansi kekere ti sulfate ammonium. Ikun omi ti o dara ko maa n fa si amuaradagba ti a mọ patapata ṣugbọn o le ṣe iranlọwọ ninu imukuro awọn eroja ti a kofẹ ni adalu ati iṣeduro ayẹwo. Awọn iyọ ninu ojutu ni a ti yọ kuro nipasẹ didọsi nipasẹ pipẹ ti cellulose ti ko nira, iyọdafẹ, tabi ikuku chromatography.
Awọn Ilana imọ-ẹrọ igbalode igba lo nlo awọn ohun elo iṣowo ti ọpọlọpọ awọn iṣowo ti o pese awọn solusan ti a ṣe ṣetan fun awọn ilana ti o yẹ. Amototo ẹda idaabobo ni a n ṣe nigbagbogbo nipasẹ awọn awoṣe ati awọn iwe iṣeto geli. Gbogbo ohun ti o ni lati ṣe ni tẹle awọn itọnisọna ati ki o fi iwọn didun ti o tọ si ọna ti o tọ ati ki o duro de ipari akoko ti o wa nigba ti o n gba ohun meji (ohun ti o wa ni opin opin iwe) ninu tube idanwo tuntun.
- Awọn ọna chromatographic le ṣee lo nipa lilo awọn ọwọn ori-oke tabi awọn ẹrọ HPLC aládàáṣiṣẹ. Iyapa nipasẹ HPLC le ṣee ṣe nipasẹ iyipada-yiyọ, paṣipaarọ-dipo tabi awọn ọna iyasọtọ iwọn, ati awọn ayẹwo ti a rii nipasẹ titobi diode tabi imọ-ẹrọ laser.
Imudarasi Agbara ati Imudaniloju Imudani
- Awọn chromatography ti o ni iyipada (RPC) ya awọn ọlọjẹ ti o da lori awọn hydrophobicity ibatan wọn. Ilana yii jẹ iyasọtọ pataki ṣugbọn o nilo fun lilo awọn ohun alumọni. Diẹ ninu awọn ọlọjẹ ti wa ni ti kojọpọ patapata nipasẹ awọn idiwo ati pe yoo padanu iṣẹ lakoko RPC. Nitorina ọna yii kii ṣe iṣeduro fun gbogbo awọn ohun elo, paapa ti o jẹ pataki fun amuaradagba afojusun lati ṣe idaduro iṣẹ.
- Iṣiro-paṣipaarọ iṣiro Ion jẹ ifọkasi iyatọ awọn ọlọjẹ ti o da lori idiyele . Awọn ọwọn le jẹ ki a ṣetan silẹ fun paṣipaaro ẹya-ara tabi paṣipaarọ cation. Awọn ọwọn paṣipaarọ ẹya-ara kan ni akoko aladuro kan pẹlu idiyele ti o gba agbara ti o ni awọn ọlọjẹ ti ko ni agbara. Awọn ọwọn paṣipaarọ iṣiparọ ni iyipada, awọn ideri ti a gba agbara ti ko ni agbara ti o fa awọn ọlọjẹ daradara. Iroyin awọn amuaradagba afojusun naa ni a ṣe nipasẹ yiyipada pH ninu iwe-iwe, eyi ti o mu abajade tabi isosipo ti awọn iṣẹ iṣẹ ti a gba agbara ti awọn amuaradagba kọọkan.
- Imukuro-iyasọtọ chromatography ( iyẹfun gel ) ya awọn ọlọjẹ ti o tobi julọ lati awọn ọmọ kekere nitori awọn ohun elo ti o tobi julọ rin irin-ajo lọpọlọpọ nipasẹ polymer ti a ti sopọ mọ agbelebu ninu iwe-iwe chromatography. Awọn ọlọjẹ ti o tobi ko ni wọ inu awọn pores ti polima nigba ti awọn ọlọjẹ ti o kere julọ ṣe, ti wọn si gun ju lati lọ nipasẹ iwe-iwe chromatography, nipasẹ ọna ti wọn ko taara. Eluate ti ni ipade ni awọn ọna ti awọn pipọ ti n sọtọ awọn ọlọjẹ ti o da lori akoko idasilẹ. Isọjade Gel jẹ ọpa ti o wulo fun iṣarosi ayẹwo amuaradagba niwon a ti gba amuaradagba afojusun ni iwọn didun diẹ ẹ sii ju ti a fi kun ni iṣaju lọ si igun. Irufẹ imupalẹ irufẹ le ṣee lo lakoko ilosoke amuaradagba ti o tobi-pupọ nitori idiwọn-owo wọn.
- Imukuro ti iṣan jẹ ilana ti o wulo julọ fun "polishing" tabi ipari ilana isọdọmọ amọradagba. Awọn ori ilẹ ninu iwe-iwe-iwe-iwe-iwe-iwe-iwe-iwe-iwe-jẹmọ jẹ agbelebu si awọn iyokuro ti o sopọ pato si amuaradagba afojusun. Awọn amuaradagba lẹhinna ni a yọ kuro lati inu iwe naa nipasẹ rinsing pẹlu ojutu kan ti o ni awọn omuran ọfẹ. Ọna yii n fun awọn esi ti o mọ julọ ati iṣẹ-ṣiṣe ti o ga julọ pẹlu awọn imọran miiran.
- SDS-PAGE jẹ electrophoresis giramu polyacrylamide, ti o ṣe ni iwaju SDS (Dodecyl sulfate soda) ti o sopọ si awọn ọlọjẹ ti nfun wọn ni idiyele ti o tobi pupọ. Niwon awọn idiyele ti awọn ọlọjẹ gbogbo ni o dọgba dogba, ọna yii ya wọn sọtọ patapata ti o da lori iwọn. Nigbagbogbo SDS-PAGE ṣe ayẹwo lati jẹ idanimọ ti amuaradagba lẹhin igbesẹ kọọkan ninu ọna kan. Bi awọn ọlọjẹ ti aifẹ ti maa dinku kuro ninu adalu, nọmba ti awọn oju-iwe ti a ti wo lori geli SDS-PAGE ti dinku, titi ti o jẹ pe ẹgbẹ kan ṣoṣo ni amuaradagba ti o fẹ.
- Imonoblotting jẹ ilana imudaniloju ti amọye ti a lo ni apapo pẹlu chromatography affinity. Awọn aporo fun amuaradagba kan pato ni a lo bi awọn iyọ lori iwe-itumọ ti chromatography affinity. Awọn amuaradagba afojusun ni idaduro lori iwe, lẹhinna yọ kuro nipasẹ rinsing awọn iwe pẹlu kan iyọ iyo tabi awọn aṣoju miiran. Awọn ẹibi ti a ti sopọ mọ awọn akole ipanilara tabi dye iranlowo ninu wiwa ti amuaradagba afojusun nigba ti o yaya lati iyokù adalu.
Awọn orisun:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Atilẹba Purification Atunwo, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.