Ṣiṣe ayẹwo DNA tun gbẹkẹle agbara wa lati lo gel electrophoresis lati ya awọn ila ti DNA ti o yatọ si iwọn nipasẹ bi kekere bi apẹrẹ akọkọ.
DNA Sequencing
Ni opin ọdun ọdun 1970, awọn ilana meji ti DNA ṣe fun awọn ohun elo DNA to gun sii ni a ṣe. Awọn wọnyi ni ọna Sanger (tabi dideoxy) ati Maxam-Gilbert (ọna ti kemikali). Ilana Maxam-Gilbert da lori ipilẹ ti nucleotide-pato nipasẹ awọn kemikali ati ti o dara ju lo si awọn oligonucleotides (awọn kukuru nucleotide kukuru, nigbagbogbo to kere ju 50 awọn alailẹgbẹ-lapapọ ni ipari). Ipo ọna Sanger jẹ diẹ sii lo nitori o ti fihan ni imọ-ẹrọ tekinolori lati lo, ati, pẹlu dide PCR ati adaṣiṣẹ ti ilana, ni a ṣe rọọrun si awọn DNA pipẹ pẹlu gbogbo awọn jiini. Ilana yii da lori idinku gigun nipasẹ awọn dideoxynucleotides lakoko awọn abajade ti ilọsiwaju PCR.
Ọna Sanger
Ni ọna Sanger, a lo itanna DNA lati ṣawari bi awoṣe ati lilo DNA polymerase, ni idaamu PCR, lati ṣe iyọda iṣiro pẹlu lilo awọn ami alakoko.
Awọn iṣiro PCR ti o yatọ mẹrin ti pese, kọọkan ti o ni ogorun kan ti awọn analogs dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) si ọkan ninu awọn nucleotides mẹrin (ATP, CTP, GTP tabi TTP). Isọmọ ti okun DNA tuntun tẹsiwaju titi di ọkan ninu awọn analogs wọnyi ti wa ni ajọpọ, ni akoko wo ni okun ti wa ni igbagbọ ti a ti ṣajọ.
Kọọkan PCR yoo pari soke ti o ni awọn adalu ti awọn gigun oriṣiriṣi ti awọn DNA strands, gbogbo dopin pẹlu nucleotide ti a pe ni dideoxy fun iṣeduro naa. Yoo lo awọn eroja gbigbọn gel lati pin awọn okun ti awọn aati mẹrin, ni awọn ọna mẹrin lọtọ, ki o si mọ iru ọna awoṣe akọkọ ti o da lori iru gigun ti awọn iyọ pẹlu ohun nucleotide.
Ninu iṣeduro Olutọju Sanger, a nlo awọn apẹẹrẹ ti a fi aami si pẹlu awọn afi-awọ-awọ oni-nọmba awọ-awọ mẹrin. Awọn aati PCR, ni oju awọn oriṣiriṣi dideoxy nucleotides, ti ṣe bi a ti salaye loke. Sibẹsibẹ, nigbamii, a ṣe idapọ awọn apapo ifarahan mẹrin naa ti a si lo si ọna kan ti gel. A ti ri awọ ti oriṣiriṣi oriṣiriṣi pẹlu lilo ina mọnamọna laini ati alaye ti a gba nipasẹ kọmputa kan ti o n ṣe awọn chromatograms ti n fihan awọn okeeke fun awọ kọọkan, lati eyi ti a ṣe le ṣeto ilana DNA awoṣe.
Ni ọna deede, ọna iṣeduro ti iṣeduro nikan jẹ deede fun awọn abajade to iwọn ti o pọju 700-800 agbe-apapọ ni ipari. Sibẹsibẹ, o ṣee ṣe lati gba awọn titobi ti o tobi ju pupọ lọ, ati, ni otitọ, gbogbo awọn ẹda, lilo awọn ọgbọn ọgbọn-ọna bi Alakoso Walking ati Shotgun sequencing.
Ni Ikọkọ Ti nrin , apakan ti o ṣeeṣe ti iwọn ti o tobi ju ni lilo nipa ọna Sanger. Awọn ipilẹṣẹ titun ti wa ni ipilẹṣẹ lati inu apa kan ti o gbẹkẹle ti ọna naa ati lo lati tẹsiwaju lati ṣe atunṣe ipin ti awọn pupọ ti o wa ni ibiti o ti awọn aiṣe atilẹba.
Ikọja ibọn kekere n ṣafẹjẹ laisi ipin ẹya DNA ti iwulo sinu awọn egungun ti o yẹ (ti o le ṣakoso), sisọsẹ oriṣiriṣi oriṣiriṣi, ati ṣeto awọn ege ti o da lori awọn abala ti o nwaye. Ilana yii ti jẹ ki o rọrun sii nipa lilo ohun elo kọmputa fun iṣeto awọn ọna fifuyẹ.