Ohun ti PCR ni lati Ṣe pẹlu Ṣiṣipopada DNA ati Awọn Genital Amplifying
Aṣeyọri imunni polymerase ( PCR ) jẹ ilana ila-jiini kan ti iṣelọpọ fun ṣiṣe awọn adakọ pupọ ti aini ati ti o tun jẹ apakan ninu ilana ilana sisẹ awọn ọna kika.
Bawo ni Aṣeyọri Ipaṣọrọ Pii Paati Pii Ṣiṣẹ?
Awọn ẹda ti a ṣe pẹlu lilo ayẹwo DNA, ati imọ-ẹrọ jẹ dara to lati ṣe awọn adakọ pupọ lati inu ọkan ẹda ti ẹda ti o wa ninu ayẹwo. PC amplification of gene to make millions of copies, laaye fun wiwa ati idanimọ ti awọn ila ila nipa lilo awọn imuposi wiwo ti o da lori iwọn ati idiyele (+ tabi -) ti ẹya DNA.
Labẹ awọn ipo iṣakoso, awọn ipele kekere ti DNA ti wa ni ipilẹṣẹ nipasẹ awọn enzymu ti a mọ ni DNA polymerases, ti o fi awọn deoxynucleotides ti o ni imọran (dNTPs) si nkan ti DNA ti a mọ ni "awoṣe." Ani awọn ege kere ju ti DNA, ti a npe ni "primers" ti lo bi ibẹrẹ fun polymerase. Awọn alakoko jẹ awọn ege kekere ti DNA (oligomers), nigbagbogbo laarin 15 ati 30 nucleotides gun. A ṣe wọn nipa gbigbọn tabi sọye awọn abajade DNA kukuru ni awọn opin ti pupọ ti o pọ sii. Lakoko PCR, DNA ti wa ni gbigbona ati awọn ilọpo meji ti o yatọ. Lori itutu agbaiye, awọn alailẹgbẹ n sopọ si awoṣe (ti a npe ni annealing) ati ṣẹda aaye fun polymerase lati bẹrẹ.
Awọn ilana PCR
Aṣeyọri awọn ohun elo polymerase (PCR) ni a ṣe nipasẹ ṣeewari ti awọn thermophiles ati awọn enzymu polymerase ti thermophilic (awọn enzymu ti o ṣetọju iduroṣinṣin ati iṣẹ lẹhin igbasẹ ni awọn iwọn otutu to gaju).
Awọn igbesẹ ti o wa ninu ilana PCR ni awọn wọnyi:
- A ṣe adalu kan, pẹlu awọn iṣeduro iṣagbeye ti awoṣe DNA, enzymu polymerase, primers, ati dNTPs. Agbara lati ṣe igbona adalu laisi denaturing enzymu naa fun laaye lati ṣafihan ti helix meji ti ayẹwo DNA ni awọn iwọn otutu ni iwọn 94 ° Celsius.
- Lẹhin ti denaturation, ayẹwo ti wa ni tutu si ibiti o ti ni diẹ sii, ni iwọn 54 iwọn, eyiti o ṣe atilẹyin idiwọ ti awọn alakoko si awọn awoṣe DNA ti o ni okun-ara.
- Ni igbesẹ kẹta ti ọmọ-ara naa, a ṣe ayẹwo si ayẹwo si iwọn 72, iwọn otutu ti o dara julọ fun Taq DNA Polymerase, fun elongation. Nigba isanwo, DNA polymerase nlo apẹrẹ DNA atilẹba ti o jẹ awoṣe lati fi awọn dNTPs ti o ni ibamu si awọn iyokuro 3 'ti gbogbo alakoko ati lati ṣẹda apakan kan ti DNA ti o ni ilọpo meji ni agbegbe ti ẹda ti anfani.
- Awọn alakoko ti o ti ṣe akojọ si awọn abala DNA ti kii ṣe deede baramu ko wa ni itọnti ni iwọn 72, nitorina o ni idiwọn opin si ila pupọ.
Ilana yii ti denaturing, imuduro ati elongation tun wa ni ọpọlọpọ (30-40) igba, nitorina npo nọmba ti awọn idaako ti o fẹ julọ ninu adalu. Biotilẹjẹpe ilana yii yoo jẹ ohun ti o dara julọ ti o ba ṣe pẹlu ọwọ, awọn ayẹwo le wa ni ipese ati ki o daabobo sinu Thermocycler ti o ṣeeṣe, ti o wọpọ julọ ninu awọn lainiọniti molulami, ati pe a le ṣe atunṣe PCR pipe ni wakati 3-4.
Igbese denaturing kọọkan ma duro ilana ilana elongation ti ọmọde ti tẹlẹ, nitorina ni o ṣe nyi okun tuntun ti DNA ati fifi o si iwọn iwọn ti o fẹ.
Iye akoko elongation le ṣee ṣe gun tabi kukuru ti o da lori titobi pupọ ti awọn ayanfẹ, ṣugbọn nikẹhin, nipasẹ awọn akoko ti o tun ti PCR, ọpọlọpọ awọn awoṣe ni yoo ni ihamọ si iwọn ti ẹyọ ayọkẹlẹ nikan, bi wọn ṣe yoo ti ni ipilẹṣẹ lati awọn ọja ti awọn alailẹgbẹ mejeji.
Oriṣiriṣi awọn ifosiwewe ti PCR ti o niiṣe ti a le fọwọ lati mu awọn esi ti o dara. Ọna ti o gbajumo julọ lati ṣe idanwo fun niwaju PCR ọja jẹ ayanfẹ gbigbọn agarose . Eyi ti a lo lati pin awọn iṣiro DNA ti o da lori iwọn ati idiyele. Awọn iṣiro naa nigbana ni oju o ni wiwo pẹlu awọn dyes tabi awọn redisotopes.
Itankalẹ
Niwon igbasilẹ ti PCR, DNA polymerases miiran ju Taq atilẹba ti a ti ṣawari. Diẹ ninu awọn wọnyi ni agbara "atunṣe" to dara julọ tabi ni ilọsiwaju diẹ sii ni awọn iwọn otutu ti o ga, nitorina o ṣe atunṣe pato ti PCR ati idinku awọn aṣiṣe lati fi sii dNTP ti ko tọ.
Diẹ ninu awọn iyatọ ti PCR ti a ṣe apẹrẹ fun awọn ohun elo kan pato ati ti a nlo ni deede ni awọn iwe-iwosan ti iṣan-molikalidi. Diẹ ninu awọn wọnyi ni Real-Time PCR ati Reverse-Transcriptase PCR. Iwari ti PCR tun jẹ ki o ni idasile ikọsẹ DNA , titẹ ọwọ DNA ati awọn ilana imularada miiran.